唯有不斷尋求，才有機會找到答案——探索未知的RNA 區段

隨後利用目標基因的 Gene-Specific Primer (GSP)，並以first-strand cDNA 為 ... 退化性引子 (degenerate primer)：用已知的胺基酸序列逆推可能的核酸 ... 公司資訊 產品資訊 參展活動 溫故知新 促銷資訊 2016年11月2日星期三 唯有不斷尋求，才有機會找到答案——探索未知的RNA區段-RACE 圖片來源/climberviapixabay,CC licensed 整理・撰文：李俊廷 在顯赫的山壁、巖然的未踏之地上，攀岩者抱持著敬畏的心，以看似樸實卻不失細膩的動作將一個個勾環釘入岩壁。

這種逐步探尋未知地帶的模式，在分子生物技術中也見得到。

今天要來跟各位介紹的技術是快速擴增cDNA末端(RapidAmplificationofcDNAEnds,RACE)。

如果說在字面上“RT-PCRvs.Real-timePCR還在傻傻分不清楚？”的話，那RT-PCR跟RACE就是在用途上，容易讓人混淆吧！ 雖然RACE為RT-PCR的變奏版，在原理跟步驟上和RT-PCR有很多相似，但RACE卻能解決很多特別的問題。

例如，分析兩端序列未知的RNA、界定啟動子(promoter)下游、調查部分胺基酸序列已知的基因等… 快速擴增cDNA末端(RapidAmplificationofcDNAEnds,RACE)，不要被這長長的名稱嚇到了！其實簡單來說，就是一種可以用來幫助你尋找RNA末端未知序列的技術。

一般來說，我們會依照分析的端點而將RACE分成3’RACE和5’RACE兩種。

下面以幾個簡單的例子分別說明： 3’RACE及5’RACE的流程： 3’ RACE 圖二.3’RACE分析真核生物mRNA 以分析某個真核生物特定基因的mRNA3’端為例，首先會藉由poly-T引子將具有poly-A tail的mRNA做為模板，反轉錄成第一股cDNA(first-strandcDNA)。

poly-T引子在設計上3’端有時會多帶一個 V(V=AorCorG)，藉此增加黏合在 poly-A與基因交界處的機率，以免poly-T 引子黏合在離基因太遠的poly-A區段上。

隨後利用目標基因的Gene-SpecificPrimer(GSP)，並以first-strandcDNA為模板，合成第二股cDNA (second-strandcDNA)。

取得含3’端未知序列的cDNA後，我們可以利用 poly-T引子與GSP擴增產物，定序先前未知的mRNA3’端。

說到這，不知大家會不會想到一個問題：如果我們的目標RNA沒有poly-Atail該怎麼辦呢？像是例如非編碼 RNA(non-codingRNA,ncRNA)或原核生物的mRNA……等。

這時就可以利用poly-Apolymerase將目標RNA3’端加上poly-A，用來仿照真核生物的mRNA3’端，就可以解決這樣的問題囉！另外，一般的反轉錄酵素在面對太長的 RNA目標時，往往會後繼無力而無法合成整段first-strandcDNA。

所以如果設計的GSP位置距離 RNA3’端太遠，以poly-T引子合成的first-strandcDNA可能就無法包含能被GSP辨識的區域。

想要解決這樣的問題，其中一種解決的策略是：先使用隨機引子(random primers)合成多種first-strandcDNA，這些 first-strandcDNA當中可能有些是包含部分未知序列且能被 GSP辨識的。

搭配random primer配合GSP擴增產物並定序取得部分未知序列的資訊後，就能設計更靠近 RNA3’端的GSP來分析剩下未知的區域。

------ 5’ RACE  圖三.5’RACE分析原核生物mRNA 範例圖 這部分，我們以分析某個原核生物特定基因的mRNA5’端為例。

首先用GSP合成first-strandcDNA後，通常會以末端脫氧核苷酸轉移酶（Terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT） 在first-strandcDNA3’端加上一段能夠被引子辨識的標靶序列(adapter)。

所謂的TdT是一種不需要模板就能合成DNA的聚合酶，因此可以直接在 first-strandcDNA3’端加上一段序列，這段序列可以依照我們給予的dNTP原料來決定，例如如果給予 poly-C。

之後就能以poly-G引子來合成second-strandcDNA。

poly-G引子在設計上 3’端有時會帶一個H(H= AorTorC)，藉此增加黏合在poly-C與基因交界處的機率。

取得含完整5’端的雙股cDNA產物後，以poly-G引子與GSP擴增目標產物，就可以將未知的5’端序列定序出來了！ 如果GSP的位置距離 RNA5’端太遠而無法合成含完整5’ 端的first-strandcDNA，也能繼續以互補adapter的引子先合成 second-strandcDNA，再用GSP配合能互補 adapter的引子擴增含部分未知序列的產物，定序取得更多資訊後就能設計更接近5’端的GSP。

------ RACE在實作上也有相當多的花招，當我們覺得 RACE的產物不夠專一時，可以藉由巢式聚合酶鏈鎖反應(NestedPCR)的概念，將原先使用的GSP 替換成另一種新的GSP並進行第二次擴增 (詳見“房屋仲介”有巢氏”，PCR也有巢式!”)。

或是當我們覺得用TdT製造adaper的步驟太繁瑣時，亦可選用能在產物3’端額外添加adapter的反轉錄酵素產品。

在應用面上，RACE也佔有重要的地位。

除了能夠藉由5’RACE來分析啟動子外（promoter），也能以某個蛋白的特徵序列設計退化性引子(degenerateprimer)1作為 GSP，再藉由RACE將某個系列的蛋白從 RNApool釣出來。

另外，實驗設計上，RACE產物的取向較RT-PCR集中，因此能夠建立較小的 cDNA文庫(cDNAlibrary)，利於我們進一步的篩選。

而當目標RNA過大而無法以RT-PCR分析全長時，我們也能以RACE逐步分段地對整條目標RNA 進行分析。

見圖四： 圖四.以RACE對Long-RNA逐步進行定序。

雖然目前具有高通量的次世代定序分析，奪去了RACE的部分風采，但秉持著能夠穩健、輕巧分析的優勢，RACE至今仍被許多實驗室應用。

經過小編今天的介紹之後，大家對於RACE有沒有比較熟悉了呢？ 名詞解釋： 退化性引子(degenerate primer)：用已知的胺基酸序列逆推可能的核酸序列，再以此資訊設計出對應的引子群。

例如：TENGIGA胺基酸序列可對應到的DNA序列為 ACNGARAAYGGNAUHGGNGCN： T(ACU,ACC,ACA,ACG) E(GAA,GAG) N(AAU,AAC) G(GGU,GGC,GGA,GGG) I(AUU,AUC,AUA) G(GGU,GGC,GGA,GGG) A(GCU,GCC,GCA,GCG) 參考資料： 維基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_amplification_of_cDNA_ends MichaelJ.McPherson,SimonGeirMøller (2006).PCR(SecondEdition)pp47-50.InUS:270MadisonAvenueNewYork,NY 10016,InUK:4ParkSquare,MiltonPa.Taylor&FrancisGroup. http://download.bioon.com.cn/view/upload/201201/18181845_7261.pdf 於 晚上11:56 以電子郵件傳送這篇文章BlogThis！分享至Twitter分享至Facebook分享到Pinterest 標籤： 溫故知新, PCR小天地 沒有留言: 張貼留言 較新的文章 較舊的文章 首頁 訂閱： 張貼留言(Atom) aboutthisblog TenGigaBio是由美國、日本以及台灣的跨國技術團隊所組成的生物科技公司。

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